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        ELISA試劑盒初學者看結果

        更新時間:2019-10-31      點擊次數:2473

        酶聯免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作,可以簡單地回答樣本中有多少蛋白質/多肽/抗體這一基本問題,是實驗室比較常用的一種檢測方法。而這種簡單的分析方法的核心,就是標準曲線。沒有它,我們的實驗就變成了一個二元的“是/不是”測試。有了它,我們可以深入研究生物反應的細節。那么,是什么使得標準曲線如此強大呢?讓我們在ELISA的背景來討論這個問題。

         

        簡單地說,標準品就是一系列已知目標蛋白數量的陽性對照。例如,如果對人類IgG進行ELISA檢測,標準曲線將包含逐漸減少的已知量的人類IgG,它會讓你立刻得出一系列的結論。

         

        1.我的ELISA實驗有效嗎?

         

        是否可以看到標準品的信號?如果可以,實驗是好的;如果沒有,就應該進行故障排除。也許抗體問題,或者系統中的其他東西沒有得到優化。

         

        2.我的ELISA檢測正常嗎?

         

        這是一個比較棘手的問題。當標準濃度下降時,信號是否減少?如果答案是肯定的,那
        就是一個好的開始。如果答案是否定的,可能在某些步驟引入了一些背景,或者移液管
        可能需要校準。

         

        3.是否在系統中引入了背景?

         

        一組適當的標準品總是以空白結束,在空白孔中不存在標準品。如果空白孔OD值為>0.1,說明可能引入了一些背景。

         

        計算未知數

         

        標準曲線的真正能量在于它能夠測定未知樣品的濃度。如果我們觀察IgG反應,我們可以將樣本的OD值與標準的OD值進行比較,并根據相對OD值得出一些結論。例如,如果我們知道一個333 ng/mL的標準品OD值在2.1左右,而一個111 ng/mL的標準OD值在1.7左右,那么我們可以假設一個未知的OD值在1.9左右應該在200 ng/mL左右。直到我們把它畫在曲線上,然后得出一個方程。當我們檢測到更多的目標時,OD值上升,當我們檢測到更少的目標時,OD值下降。

         

        OD值

         

        那么,曲線一定是線性的嗎?這看起來不太對。坦白地說,這和我們的眼睛告訴我們的并不相符。如果我們有1200ng /mL的濃度,OD值會是3嗎?當然不是。數據看起來接近一條水平漸近線——曲線不會通過這個值。所以不管濃度有多高,都不會超過2.5左右。類似地,這條曲線似乎表明,如果濃度為負,可以生成OD值在0.5左右。

         

        4.參數對數曲線

         

        使用圖1的數據來擬合,得到如下s曲線。這條曲線非常清楚地顯示了水平漸近線,同時也顯示了標準濃度增加或減少時的良好的、與劑量相關的響應。

         

        s曲線

         

        四參數方程的擬合函數表達式為:

         

        擬合函數

         

        在這個方程中,“a”和“d”分別表示可以得到的小值和大值——我們的漸近線。“c”表示拐點——曲線的中點,“b”表示曲線在“c”處的斜率。根據這個方程,我們現在可以反算出一個樣本的未知濃度。大多數ELISA閱讀器都可以自動完成這項工作。

         

        它不于競爭法, 夾心法也可以用它。它的形狀, 根據情況, 可能是一個單調上升的類似指數, 對數, 或雙曲線的曲線, 也可能是一個單調下降的上述曲線, 還可以是一條 S 形曲線。 它要求 X 值不能小于 0 (因為指數是實數, 故有此要求)。 在很多情況下它都可以擬合 ELISA 的反應曲線, 所以它也成了 ELISA 中應用廣的模型之一。

         

        當使用4參數擬合曲線時,記住一些實用的技巧是有幫助的。由于以漸近線開始和結束,曲線范圍之外的數據可能會產生不準確的結果。更進一步說,試著在S中間標準曲線的線性范圍內工作。一般來說,未知計算在曲線的線性范圍內更準確??梢韵♂尦鰳藴是€范圍的樣本,根據標準曲線計算濃度,然后根據初始稀釋值乘以相應倍數。

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